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불완전한 단백질 이동이 wb? 대문자가 도움이 될 수 있습니다! 2018-11-16 17:57:01

우리는 항상 웨스턴 블랏 (wb)에서 다양한 문제를 겪었습니다.
  • 단백질의 불완전한 전이?
  • 높은 배경?
  • 긍정적 인 밴드가 없습니까?

......

아래에서 우리는 단백질 전달의 문제에 대한 가능한 이유에 대한 상응하는 해결책을 제시 할 것이고, 실험에서 성공할 수 있기를 희망 할 것입니다.



1. 단백질 전달이 필요한 이유는 무엇입니까?


웨스턴 블랏은 단백질이 막으로 옮겨져 항체를 사용하여 검출되는 방법입니다. 알려진 발현 단백질의 경우 해당 항체를 검출 용 1 차 항체로 사용할 수 있으며 새로운 유전자의 발현 산물은 항체의 융합 부위에서 검출 할 수 있습니다.


페이지 상으로 분리 된 단백질 시료를 고상 담체 (예를 들면, 니트로 셀룰로오스 막)에 옮기고, 고상 담체가 비공유 결합으로 단백질을 흡착하고, 폴리펩티드의 종류 및 그 생물 활성을 유지할 수있다. 고상 담체상의 단백질 또는 폴리 펩타이드를 항원으로 사용하여 해당 항체를 면역 반응시킨 후 효소 또는 동위 원소 표지 된 2 차 항체와 반응시켜 특정 발현 단백질을 기질 발색 또는 오토 라디오.


2. 불완전한 이전의 이유와 해결책


원인
솔루션
필름이 완전히 흠뻑 젖지 않았다.
100 % 메탄올 투과 막 사용
표적 단백질의 분자량이 10,000 미만
작은 구멍 크기의 멤브레인을 선택하여 이동 시간 단축
목적 단백질의 등전점은 전달 완충액의 ph와 같거나 근접하다
다음과 같은 다른 버퍼를 사용해보십시오.n- 시클로 헥실 -3- 아미노 프로판 술폰산(캡) 완충액 (ph 10.5) 또는 아세트산 완충액
메탄올 농도가 너무 높음
과량의 메탄올 농도는 단백질을 sds로부터 분리시키고, 이에 의해 겔에서 침강하면서 겔을 수축 또는 경화시킴으로써 고 분자량 단백질의 전달을 억제한다. 메탄올 농도를 줄이거 나 대신 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하십시오.
불충분 한 전송 시간
두꺼운 겔 및 고 분자량 단백질의 연장 된 이동 시간


3. 준비 방법대문자cas 1135-40-6) 버퍼


다음 표를 참조하십시오 (버퍼와 수산화 나트륨의 농도는 모두 0.1 mol / l 임).


ph 캡 버퍼
볼륨 (대문자)
볼륨 (naoh)
6.8
250
0
10.0
218.3
31.7
10.5
178.6
71.4
10.8
156.3
93.7
11.2
138.9
111.1

제제의 구체적인 조작은 0.1 mol / l모자완충 용액을 부피 플라스크에서 먼저 제조한다. 구성 과정 중에, 완충액은 고온에서 탈수되고 데시 케이 터에서 냉각되어야하며; 0.1 mol / l의 수산화 나트륨 용액도 동시에 제형 화된다. 상기 표의 식에 따라, ph에 상응하는 완충액을 제조 할 수 있고, 수산화 나트륨이 주로 ph를 조절하는데 사용된다.


웨스턴 블 랏팅은 단백질 혼합물로부터 표적 단백질을 검출하고, 세포 또는 조직에서 단백질의 발현을 정량적 또는 정 성적으로 결정하고,이어서 단백질 - 단백질, 단백질 - DNA 및 단백질 - rna 상호 작용을 분석하는데 적용될 수있다. 필름 전송은 wb의 기초이며, 그 품질은 wb의 성공의 열쇠입니다. 위의 방법으로 transfor 과정에서 성공하는 데 도움이되기를 바랍니다.



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